Определение спонтанной активности миелопероксидазы нейтрофилов в растворе (модифицированный метод) со спектрофотометрическим учетом результатов

Для определения спонтанной активности MPO, секретируемой из азурофильных гранул в среду инкубации, была использована модифицированная нами лабораторная тест-система со спектрофотометрическим учетом результатов.

Для этой цели в полистирольные пробирки для микроанализа, содержащие свежевыделенную суспензию Нф, в концентрации 100, 200, 300, 400х103 кл/мл добавляли по 200 мкл субстратной смеси. Пробы инкубировали при +37оС в течение 15 мин, реакцию останавливали добавлением 10% серной кислоты.

Рисунок 3.3 - Спонтанная активность миелопроксидазы интактных нейтрофилов в растворе (модифицированный метод)

Как видно из представленных результатов (рисунок 3.3), зависимость между концентрацией клеток в экспериментальных пробах и ферментативной активностью MPO, высвобождаемой из азурофильных гранул, носит практически линейный характер и разброс межу отдельными значениями в каждой экспериментальной точке незначителен. Это позволяет предположить, что чувствительность данной лабораторной тест-системы достаточно высока и позволяет использовать ее в качестве лабораторного метода определения пероксидазной активности с нижним пределом концентрации клеток в пробе, равным 100х103/мл.

Высокие показатели активности MPO, выраженные в единицах оптической плотности, напрямую коррелируют с концентрацией клеток в пробе. Определение активности MPO таким методом позволяет оценить спонтанную секрецию фермента, определяющего уровень биоцидности Нф, интактными клетками, без разрушения целостности клеток, без использования методов иммобилизации клеток на твердых носителях (увеличивая тем самым эффективную концентрацию полиморфноядерных гранулоцитов на этапе взаимодействия MPO c субстратом). Субстратная хромогенная смесь вносится в пробирки для микроанализа сразу после внесения туда экспериментальной пробы, значительно снижая также время постановки теста. Таким образом, эксперимент проводится в растворе и включает только одну стадию центрифугирования проб перед спектрофотометрической оценкой результатов.

Для сравнительной оценки методов определения спонтанной активности MPO нейтрофилов были использованы непараметрические методы статистической обработки данных: критерий Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, Вальда-Вольфовица.

Анализ полученных результатов показал, что существуют достоверно значимые различия между уровнем пероксидазной активности Нф, выраженной в единицах оптической плотности, с применением модифицированного метода и в тесте с использованием клеток, иммобилизованных на гидрофобной поверхности (относительно концентрации клеток в пробе 300х103/мл и 400х103/мл) а также между уровнем активности фермента на основе модифицированного метода и в тесте с применением лизированных полиморфноядерных гранулоцитов (относительно концентрации клеток в пробе 100х103/мл и 400х103/мл (см. Приложение А, Б).

Уровень ферментативной активности Нф в растворе (модифицированный метод) значительно превышает таковую в отношении клеток, иммобилизованных на гидрофобной поверхности, и в меньшей степени в отношении клеток в тест-системе, использующей лизированные Нф. Разница между показателями активности MPO (относительно среднего значения ферментативной активности в каждой экспериментальной точке для всех доноров в исследуемой выборке) между методом определения данной активности в растворе на основе модифицированного метода и при помощи твердофазного носителя в экспериментальных пробах, содержащих 300х103 кл/мл - 24%, содержащих 400х103 кл/мл - 23 %.