Определение активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов в тесте с использованием клеток, иммобилизованных на гидрофобной поверхности

Для определения спонтанной секреции MPO азурофильных гранул полиморфноядерных гранулоцитов была использована тест-система, достаточно широко используемая в лабораторной практике, включающая Нф, предварительно иммобилизованные на поверхности полистирольного планшета с концентрацией клеток в экспериментальной пробе, равной 100, 200, 300, 400х103 кл/мл, с последующим внесением субстратной смеси, состоящей из перекиси водорода и ортофенилендиамина в рабочем буфере. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 492 нм.

Высвобождение депонированного фермента в среду инкубации происходит благодаря феномену «слияния мембран» азурофильных гранул и плазматической мембраны Нф. Основной эндогенный фактор слияния - ионы Са2+, резко снижающие гидратационный барьер при интеграции мембран. Ионы Са2+ нейтрализуют отрицательный поверхностный заряд, непосредственно модифицируя структуру липидного бислоя и дестабилизируют ее, создавая кальциевые мостики между двумя контактирующими мембранами, и тем самым индуцируя соединение мембран. Образование окрашенного продукта пероксидазной реакции, выраженное в единицах оптической плотности, происходит в результате способности MPO окислять ортофенилендиамин в присутствии перекиси водорода.

Как видно из представленных результатов (рисунок 3.1) в тестах данной

Рисунок 3.1 - Активность миелопероксидазы нейтрофилов периферической крови в твердофазном спонтанном тесте

Конструкции при использовании выбранных концентраций клеток наблюдается изменение спонтанной ферментативной активности миелопероксидазы иммобилизованных клеток для проб, содержащих 100, 200, 300 и 400 тысяч кл/мл линейного характера. Количество единиц оптической плотности, на которые происходит увеличение активности фермента в каждой экспериментальной точке, отражает среднее значение ферментативной активности Нф для всех доноров в исследуемой выборке.

Таким образом, можно предположить, что данная тест-система носит линейную зависимость между количеством иммобилизованных клеток и миелопероксидазной активностью Нф. Общее количество окрашенного продукта пероксидазной реакции, выраженное в единицах оптической плотности, зависит от концентрации секретируемой из азурофильных гранул MPO.

Такая зависимость, выраженная в единицах оптической плотности, отражает хорошую чувствительность и воспроизводимость результатов и позволяет использовать для анализа количество клеток, равное 200-300х103/мл.

Достоинством твердофазной тест-системы является малое время для выполнения лабораторного теста и его небольшая трудоемкость, также количественный спектрофотометрический учет результатов.

К недостаткам данной лабораторной системы можно отнести стадию иммобилизации клеток на полистироле. Это с одной стороны, уменьшает эффективную концентрацию клеток на стадии активного взаимодействия MPO с субстратом, с другой стороны, способствует появлению большей вариабельности получаемых значений для одной экспериментальной точки, так как адгезивные свойства полиморфноядерных гранулоцитов у разных доноров могут варьировать в значительных пределах.