Фармацевтическая этика
Становление этики и деонтологии...

Современная медицинская деонтология, рассматривая проблемы долга, деятельности медицинских и фармацевтических работников, исходит из специфики их труда.

Физическая реабилитация
Анатомо-физиологическая характеристика...

Учитывая то, что проблема остеохондроза не только медицинская, но и социальная, решить ее очень сложно. Однако наше здоровье - это только наше здоровье.

Здоровый образ жизни
Основы физического здоровья...

Здоровый образ жизни - образ жизни человека, направленный на профилактику болезней и укрепление здоровья. Понятие «здоровый образ жизни» однозначно пока ещё не определено.

Методы оценки ферментативной активности нейтрофилов

Б) Цитохимические методы

Пероксидаза является ферментом - лизосомальной каталазой, катализирующей в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. При окислении ортотолидина или бензидина, используемых в реакциях, образуются интенсивно окрашенные соединения, в том случае, если в клетке присутствует пероксидаза, при взаимодействии с которой перекись водорода разрушается с выделением кислорода, который и окисляет орто-толидин или бензидин, переводя их в окрашенные соединения (рисунок 1.3). В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема-Кнолля или его модификаций [2, 45].

Рисунок 1.3 - Реакция на миелопероксидазу

Метод Грэхема-Кнолля. В присутствии миелопероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин.

· Свежие мазки фиксируют 4% формалиново-спиртовым раствором в течение 30 секунд.

· Обмывают в проточной воде и высушивают.

· Заливают пероксидазным реактивом на 5 минут.

· Тщательно промывают в проточной воде и высушивают.

· Докрашивают красителем Романовского-Гимзы.

· Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул [20].

В) Спектрофотометрический метод определение активности миелопероксидазы в клеточном лизате Нф

Содержание MPO в лизате Нф оценивают количественным спектрофотометрическим методом с использованием 0,04% раствора ортофенилендиамина (ОФД) на фосфатном буфере с pH 5,0 и добавлением 0,33% раствора перекиси водорода в соотношении 20:1 по объему. Длина волны 495 нм [36].

· Нф помещают дистилированную воду; получают клеточный лизат.

· Производят титрование лизата

· Добавляют пероксидазный субстрат

· Измеряют оптическую плотность [44].

) Определение активности кислой фосфатазы

В лунки плоскодонного 96-луночного планшета, содержавшего фиксированные клетки, вносится по 50 мкл раствора паранитрофенилфосфата (ПНФФ-раствор, ICN). Для его приготовления 0,09 г ПНФФ и 0,31 г NaCl растворялось в 37 мл 1М натрий-цитратного буфера (рН 5,5). Образцы инкубируются при 37°С в течение 30 мин. Затем добавлением 0,2 М раствора NaOH по 100 мкл на лунку реакция останавливается. Оптическая плотность раствора измеряется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 405 нм. [51].

) Определение активности цитохромоксидазы

Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,5, добавляем 20 мг 3,3*-diaminobenzidine (ICN), 100 мг MnCl2 и 300 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносится в лунки планшета, содержащие фиксированные клетки. Планшет инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакция останавливается добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическая плотность определяется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм [39].

) Определение активности лактатдегидрогеназы

К адгезированным и фиксированным на пластике клеткам добавляется 100 мкл раствора iodonitrotetrazolium violet (йоднитротетразолий, ЙНТ, производства ICN) с концентрацией 2 мг/мл. Для этого 20 мг ЙНТ растворяется сначала в 0,5 мл 70° спирта, а затем добавляется 9,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора MnCl2. Монослой клеток вместе с раствором ЙНТ инкубируется при 37°С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляется, монослой клеток дважды отмывается раствором Хенкса и высушивается. Расположенные внутриклеточно гранулы диформазана растворяют 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,04 М HCl, в течение 20 мин. Оптическая плотность раствора определяется на микроплатном рейдере при длине волны 492 нм .

Перейти на страницу: 1 2 3

Меню сайта

Голодание человека

Виды массажа

Венерические заболевания

Вегето-сосудистая дистония

Биомедицинская и клиническая антропология

Беременность и эпилепсия

Медицинские решения