Методы оценки ферментативной активности нейтрофилов

Оценка ферментативной активности Нф используется при оценке иммунного статуса организма. Ферментативную активность клеток определяют для ферментов: миелопероксидазы, аденозинтрифосфатазы, кислой фосфатазы, нитро-синего тетразолия, цитохромоксидазы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и катионных белков [27].

) НСТ-тест. Принцип НСТ-теста состоит в образовании нерастворимых окрашенных гранул формазана при восстановлении нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным анион-радикалом, образующимся при активации Фк. Этот тест отражает степень активизации кислородозависимых механизмов бактерицидной активности Фк, в основе которых лежит активация НАДФ-Н2-оксидазы и гексозомонофосфатного шунта. Электроны, освобожденные с НАДФ-Н2, превращают молекулярный кислород в супер-оксиданион, восстанавливающий нитросиний тетразолий. Различают спонтанный НСТ-тест с интактными полиморфноядерными лейкоцитами, не подвергавшимися воздействию стимуляторов, и индуцированный [16, 39].

Выделенная клеточная взвесь с концентрацией 2×106 кл/мл на основе среды 199, включающей НСТ (nitro blue tetrazolium 0,5 мг/мл), делится на две части и в половину из проб вносится S.aureus в концентрации 2×107 кл/мл. Затем взвесь клеток с бактериями и без них разносится по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета по три на каждый образец. После инкубации при 37°С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывается теплым раствором Хенкса без фенолового красного от раствора НСТ и непоглощенных бактерий и высушивается. Монослой клеток фиксируется в парах формалина в течение 15 мин. Затем клетки разрушают путем добавления в лунки предварительно разогретого до 83°С диметилсульфамида (DMSO, производство «ICN») по 50 мкл. Оптическая плотность полученных растворов измеряется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 540 нм [46].

) Тесты на фиксированных образцах

Определение активности ферментов проводится на фиксированных образцах, которые приготовляются следующим образом. Выделенная клеточная взвесь с концентрацией 2×106 кл/мл делится на две части и в половину из проб вносится S.aureus в концентрации 2×107 кл/мл. Затем взвесь клеток с бактериями и без них разносится по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета по три на каждый образец. После инкубации при 37°С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывается теплым раствором Хенкса без фенолового красного от непоглощенных бактерий и высушивается. Затем фиксируют в парах формалина в течение 15 мин, после чего исследуют ферментативную активность клеток [49].

) Определение активности миелопероксидазы

А) Твердофазный метод

Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) добавляется 4 мг o-phenylenediamine (ICN) и 500 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносится в лунки планшета, содержащие адгезированные на пластик и фиксированные клетки. Планшет инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакция останавливается добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическая плотность раствора определяется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм) [38].