Исследование и его методы

Набор реагентов для иммуноферментного выявления

Набор реагентов «Ротавирус - антиген - ИФА - Бест» (далее по тексту - набор) предназначен для выявления антигена ротавируса человека методом твердофазного иммуноферментного анализа в вирусодержащих культуральных жидкостях при лабораторных исследованиях, в экстрактах фекалий при клинических исследованиях, в образцах питьевой и сточной воды, воды открытых водоемов.

Набор рассчитан на проведение 96 определений, включая контроли, или 12 независимых постановок по 8 анализов каждая, включая контроли [2].

Принцип метода

Специфическими компонентами набора являются моноклональные антитела к группоспецифическому антигену ротавирусов человека, иммобилизованные в лунках планшета; конъюгат поликлональных антител к ротавирусам с пероксидазой хрена и контрольный положительный образец.

Принцип метода заключается во взаимодействии антигена ротавируса с моноклональными антителами, иммобилизованными в лунках полистиролового планшета. Комплекс «антиген-антитело» выявляют с помощью иммуноферментного конъюгата.

После удаления избытка несвязавшегося комплекса и инкубации с раствором ТМБ, происходит окрашивание раствора в лунках. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации антигена ротавируса в анализируемых образцах. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм, референс-волне в диапазоне 620-655 нм.

Оборудование и материалы, необходимые при работе с набором

спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий проводить измерения оптической плотности растворов лунках стрипов в двухволновом режиме: при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-655 нм; или при длине волны 450 нм;

Способ применения

Для выявления антигена ротавируса в фекалиях предварительно готовят экстракт 20%-ной суспензии фекалий. Исследуют надосадочную жидкость.

Определение антигена ротавируса в экстрактах фекалий

Внести: по 100 мкл К+, К-;

По 100 мкл анализируемых образцов.

Внести: по 100 мкл рабочего раствора конъюгата.

Инкубировать: 30 мин, 37 С.

Промыть: промывочным раствором, 400 мкл (600-700 мкл в режиме переполнения), 5 раз.

Внести: по 100 мкл рабочего раствора тетраметилбензидина.

Инкубировать: 25 мин, 18-25 С, в темноте.

Внести: по 100 мкл стоп-реагента.

Измерить: ОП при 450 нм / референсная длина волны 620-655 м.

На основании получинных данных вычислить критическое значение оптическое плотности (ОПкрит) по формуле:

ОПкрит = ОПср(К⁻) + 0,2

Положительным, если ОПобр ≥ ОПкрит, где ОПобр - оптическая плотность исследуемого образца.

Результат анализа считают отрицательным, если ОПобр<ОПкрит

Набор реагентов для иммуноферментного выявления антигена аденовируса человека

Принцип метода

Специфическими компонентами набора являются моноклональные антитела к антигенам аденовируса человека, иммобилизованные в лунках планшета; конъюгат моноклональных антител к аденовирусу с пероксидазой хрена и контрольный положительный образец.

Принцип метода заключается во взаимодействии антигена аденовируса с моноклональными антителами, иммобилизованными в лунках полистиролового планшета. Комплекс «антиген -антитело» выявляют с помощью иммуноферментного конъюгата.

Количество связавшегося коньюгата выявляют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации антигена аденовируса в анализируемом образце.

Краткая схема ИФА

Внести: по 100 мкл К⁻, К⁺:

По 100мкл образцов.

Внести по 100 мкл рабочего раствора коньюгата

Инкубировать: 30 мин, 37С.

Промыть: промывочным раствором, 400 мкл (600-700 мкл в режиме переполнения),

раз.

Внести: по 100 мкл рабочего раствора тетраметилбензидина.

Инкубировать: 25 мин, 18-25С, в темноте.

Внести: по 100 мл стоп-реагента

Измерить: ОП при 450нм/референсная длина волны 620-655 нм.

На основании получинных данных вычислить критическое значение оптической плотности (ОПкрит) по формуле: ОПкрит=ОПср.К⁻+0,2

Результат онализа считают положительным, если ОПобр≥ОПкрит,где ОПобр - оптическая плотность исследуемого образца.