Влияние тромбоцитов и фосфолипидов на скорость реакций свертывания

Как упоминалось выше (раздел 1.1), для прохождения почти всех реакций свертывания необходимо наличие фосфолипидных мембран. Известно, что существует три механизма, с помощью которых скорость реакции на мембране может увеличиваться [98]:

. Ориентация молекул, сидящих на мембране, может приводить к тому, что большее число столкновений окажутся результативными.

. Эффект "сгущения" реагентов из объема в тонкий слой, прилегающий к поверхности мембраны [61].

. Большая эффективность двухмерной диффузии по сравнению с трехмерной (так называемая "редукция размерности").

Эти механизмы приводят к увеличению скоростей мембранно-связанных реакций на порядки при добавлении в систему фосфолипидных поверхностей. При этом кинетические параметры таких реакций зависят от концентрации добавленных поверхностей. При построении модели возникает проблема: как быть, если значения констант определялись при одной концентрации фосфолипидов, а моделируемый эксперимент проводится при другой?

Пусть у нас есть реакция, в которой и фермент, и субстрат связаны с поверхностью искусственных фосфолипидов (например, активация протромбина протромбиназой (или фактором Xa) или активация фактора X внутренней теназой (или фактором IXa)). Пусть SB и EB - концентрации связанных реагентов по отношению к всему реакционному объему V. Если реакция связывания быстрая, то эти величины будут зависеть от полных концентраций по закону вида

(79)

где [PCPS] - концентрация фосфолипидов, SE - стехиометрия связывания, Kd - константа диссоциации. Пусть Ssh и Esh - их концентрации в тонком примембранном слое, суммарный объем которого - Vsh. Очевидно,

(80)

(81)

Внутри оболочки реакцию считаем подчиняющейся кинетике Михаэлиса-Ментен. Скорость увеличения концентрации продукта в оболочке

(82)

Увеличение объемной концентрации при этом

= (83)

Отсюда получаем, что наблюдаемая константа Михаэлиса для такой системы пропорциональна концентрации фосфолипидов, [PCPS], а каталитическая константа от нее не зависит, результат, хорошо согласующийся с экспериментальными данными для упомянутых выше белков [72, 84, 70]. В случае, если фермент представляет собой комплекс, например, протромбиназы, концентрация его равна:

(84)

В литературе есть экспериментальные данные по человеческой теназе только для [PCPS]=25 мкМ. В моделируемых нами экспериментах [PCPS]=200 мкМ, на порядок больше. На этом основании мы увеличили константу Михаэлиса с 190 до 4000 нМ, используя для верификации Рис. 12.

Рис. 13. Образование фактора Xa в очищенной системе, содержащей факторы IX, X, VIII, V, II в концентрациях, указанных в Таблице 1. Активация производится 1.25 пМ комплекса VIIa-TF. Экспериментальные данные (●) взяты из работы [87]. Теоретические расчеты (гладкие кривые) произведены по модели (9-34). Константа Михаэлиса для активации фактора X внутренней теназой равна 190 нМ (пунктир) или 4000 нМ (сплошная линия). Все остальные константы соответствуют Таблице 2

Рассмотрим аналогичную задачу для реакции протромбиназы, протекающей на тромбоцитах. В отличие от искусственной поверхности, на тромбоцитах сначала связывается фактор Va, а затем с ним связывается фактор Xa [83]. Концентрация связанного с мембраной фактора Va есть

(85)